組織、細(xì)胞到底該如何裂解？

組織、細(xì)胞到底該如何裂解？

實(shí)驗(yàn)過程中難免會(huì)遇到特殊樣本比如組織和細(xì)胞，那我們我們又該如何來處理呢？常見的處理方法就是用RIPA來裂解。如發(fā)現(xiàn) RIPA 有沉淀，請(qǐng)放室溫半小時(shí)或者常溫水浴使沉淀溶解。根據(jù)使用量，取每 1ml RIPA 加入 10ul PMSF，使 PMSF 的終濃度為 1mM，混勻備用（PMSF 現(xiàn)用現(xiàn)加）。

1、樣品前處理：

a)對(duì)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用 PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。按照 6 孔板每孔細(xì)胞量加入

150-250 ul 裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。

b)對(duì)于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，按照 6 孔板每孔細(xì)胞量加入 150-250ul 裂解液的比例加入裂解液，用手

指輕彈懸浮細(xì)胞以充分裂解。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成 5-10×10 5 細(xì)

胞/管，然后再裂解。

c)對(duì)于組織樣品：把組織剪切成細(xì)小的碎片。按照每 20mg 組織加入 150-250ul 裂解液的比例加入裂解液

(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量) 。

用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。

2、后處理：

將裂解后的樣品 10000-14000g 離心 3-5 分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的蛋白濃度測(cè)定、SDS-PAGE、Western

blotting 和免疫沉淀等操作。

注意事項(xiàng) ：

1、 使用本裂解液可以裂解細(xì)胞核，釋放出核蛋白的同時(shí)，也會(huì)將基因組一并釋放出來，造成細(xì)胞裂解液粘

稠，此時(shí)可以直接加入蛋白上樣緩沖液煮沸再離心，離心后直接上樣電泳；若想測(cè)定濃度，可入加少量 SDS

（1%），煮沸后離心測(cè)濃度。

2、 本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑，所以不適合使用 Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，請(qǐng)

選擇 BCA 法或者 Lowry 法檢測(cè)蛋白濃度。

3、 如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散粘稠狀物，隨后離心取上清

用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。